本文刊登于《中国实用妇科与产科杂志》2022,38(6)：599-604
DOI：10.19538/j.fk2022060107
【引用本文】阮祥燕，程姣姣，杜娟，等.卵巢组织冻存移植保护女性生育力的临床应用［J］.中国实用妇科与产科杂志，2022,38(6)：599-604.
作者：阮祥燕，程姣姣，杜娟，谷牧青
基金项目：北京市自然科学基金（7202047）；首都卫生发展科研专项（2020-2-2112）；北京市医院管理局“登峰”计划专项经费资助（DFL20181401）
作者单位：首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院内分泌科，北京 100026
在我国人口快速老龄化和生育率下降的背景下，女性的生殖功能、儿童和青少年的健康显得非常重要。癌症患者享有与正常人同样的生育权利，但治疗癌症在挽救患者生命的同时，却可能严重损害了儿童及年轻女性的生育力。因此，评估治疗对性功能和生殖功能的影响是现代癌症治疗的重要内容。现有文献表明，无论在癌症开始治疗前还是在癌症治疗期间，年轻女性往往没有得到关于未来生育力的充分咨询。未来生育力对肿瘤患者非常重要，癌症治疗导致的不孕是许多癌症幸存者痛苦的来源。
胚胎冻存、卵母细胞冻存是临床常用的生育力保护（fertility preservation，FP）方法，但对于青春期前、性腺毒性治疗紧急、无法延迟且早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）风险高的年轻女性来说，卵巢组织冻存是一种新兴的惟一的生育力保护方法。卵巢组织冻存移植（ovarian tissue cryopreservation and transplantation，OTCT）技术指的是在患者经历性腺毒性治疗之前或POI风险高的患者卵巢功能衰退前，将部分卵巢组织取出，在体外冻存起来，待未来有生育需求时再将冻存的卵巢组织复苏移植回自身体内。据报道，全球已有超过1万名女性接受了卵巢组织冻存，有360多例患者经历了卵巢组织移植，移植后95%的女性恢复了卵巢内分泌功能，移植后卵巢功能的平均持续时间为2~5年，已有200多例健康子代通过此技术诞生。与冷冻卵母细胞和胚胎相比，卵巢组织移植可恢复生育力和激素分泌功能。2019年美国生殖医学学会发布声明指出，卵巢组织冻存技术不再是试验性技术。本文主要聚焦于卵巢组织冻存移植生育力保护技术的临床应用。
1 卵巢组织冻存移植技术的历史与发展
1960年人们首先在啮齿类动物上进行卵巢组织冻存与移植后实现了活产，1994年在哺乳动物羊身上实现了卵巢组织冻存移植后的活产，1996年进行了人类卵巢组织成功冻存。21年前报道了首例成功移植人卵巢组织，随后2004年报道了人自体卵巢组织移植后的全球首例活产。在丹麦，卵巢组织冻存从1999年开始在临床上应用。截止到2020年，已有近1300名丹麦儿童和年轻女性接受了卵巢组织冻存，并且100多名女性接受了卵巢组织移植。因此，该技术被视为一种“希望技术”。
2011年德国首例冻存卵巢组织移植后婴儿诞生。FertiPROTEKT网络是世界上最大的卵巢组织冻存库之一，2003—2017年冻存了1300多例患者的卵巢组织，为分布在德国各地的108个临床中心提供卵巢组织冻存服务。截止到2018年1月，126名女性经历了163次卵巢组织移植手术。卵巢组织移植后临床妊娠率约为47%，活产率约为35%~43%，通过优化卵巢组织冻存和移植手术，出生率将进一步增加。为了确保每例患者卵巢组织冷冻、保存和移植的质量，建议卵巢组织冻存应中心化进行。
笔者团队2016年成功完成了中国首例冻存卵巢组织移植手术，2018年笔者牵头制定了中国首部卵巢组织冻存与移植指南，2020年报道了中国前10例冻存卵巢组织成功移植案例，2020年成功实现了中国冻存卵巢组织移植后的首例自然妊娠，2021年成功实现了中国冻存卵巢组织移植后首例健康婴儿的诞生。
2 卵巢组织冻存移植技术
2.1 卵巢组织冻存前的评估 卵巢组织冻存适用于需要性腺毒性治疗的肿瘤、非肿瘤性疾病患者的生育力保护与卵巢内分泌功能的保护，是青春期前女童、放化疗无法延迟的育龄女性生育力保护的惟一方法。患者卵巢组织取材时具有一定的卵巢储备，原发疾病预后较好，POI发生风险高是重要的筛选指标。肿瘤患者必须排除卵巢恶性肿瘤或卵巢转移，转移风险高的患者慎用，卵巢转移高风险疾病包括白血病、神经母细胞瘤、伯基特淋巴瘤。研究表明，白血病患者卵巢组织冻存前达到完全缓解可增加卵巢组织的安全性，达到完全缓解期的化疗不会改变卵巢组织移植的结局，不再是禁忌证。生育力保存指南规定在化疗已开始的情况下，OTCT是FP的首选方法，因为成熟卵母细胞冷冻在这种情况下是无效的。在卵巢组织冻存和移植前，对于卵巢组织携癌风险的患者，需进行安全性评估，主要包括病理检查和肿瘤特异性标志物免疫组织化学检测，卵巢组织异种移植至裸鼠体内，可应用肿瘤特异性分子流式细胞技术、聚合酶链式反应技术，还可以选择二代测序技术（next generation sequencing technology，NGST）以及随着时代发展产生的新技术、精准技术。
卵巢组织冻存前应评估患者卵巢储备功能，基础卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平仍是POI最可靠的诊断指标，与低雌二醇水平共同出现，确定FSH 25U/L为POI的临界值，或提示卵巢储备功能差。抗米勒管激素（AMH）是由生长中的小卵泡产生的，间接反映了剩余原始卵泡数量，即卵巢储备。然而，重要的是，AMH水平低并不能预测短期生育力；同样，在已恢复自然月经的癌症幸存者中，AMH水平与生育力的相关性差异很大，这仍需更多研究。窦卵泡计数（AFC）的超声评估也有潜在的价值，因为它可以单独作为反映卵巢储备的替代指标。爱丁堡标准指出，卵巢组织冻存的年龄限制为35岁，而其他国际出版物提到的最高年龄为40岁。有研究表明，冻存时年龄小于35岁的女性在卵巢组织移植后的妊娠率为33%，而在＞35岁的女性中，妊娠率为18%；40岁以上的女性中，没有一例能够妊娠，但临床中也要根据患者情况，个体化处理。
2.2 卵巢组织取材 卵巢组织取材一般采用微创腹腔镜手术，也可以在肿瘤开腹手术的同时进行卵巢组织取材。在取材时，条件允许的情况下可以进行输卵管通液，如果发现单侧输卵管闭塞，应在此侧进行卵巢组织取材，以便保留输卵管通畅的一侧仍有潜在功能的卵巢组织。卵巢组织取材要避开黄体、排卵前卵泡或卵巢囊肿，因为这些位置的卵泡密度低。取材不要用电刀，以减少对卵泡的破坏。除对剩余卵巢组织行常规病理检查外，取材的卵巢组织也应对其部分样本（至少2mm×2mm）进行组织学检查，以抽查恶性细胞。取材量至少为单侧卵巢的1/2~2/3。后续治疗的性腺毒性风险越高，应冻存的卵巢组织就越多，在POI风险很高的情况下，可切除单侧整个卵巢。青春期前女性由于卵巢体积较小，可以切除整个卵巢。研究表明，切除单侧卵巢后，绝经时间提前大约1年。为降低化疗有可能增加术后出血、感染等潜在风险，建议卵巢组织取材3~7d后开始放化疗。
2.3 卵巢组织转运 没有卵巢组织冻存库的医院可将卵巢组织转运到卵巢组织冻存中心进行组织处理、冷冻、冻存等。大多研究表明，4℃~8℃低温转运是最佳的转运温度，低温可使得组织/器官中的细胞新陈代谢降低，对氧气的需求相应减小，同时也减少了氧气消耗。卵巢库提供专用的转运箱，确保转运的整个过程中保持在4℃~8℃。目前还没有充分的证据指出不会导致卵泡明显损伤和卵泡丢失的最长低温转运时间。研究表明，卵巢组织低温转运时间可持续长达24h，不会对卵巢储备造成持久的损害。
2.4 卵巢组织处理、冻存 卵巢组织一般处理为4mm×8mm×1mm大小的卵巢皮质片，对于青春期前女童的卵巢皮质，因卵泡密度高，可适当减小皮质片的大小，一般为3mm×6mm×1mm。一般来说，生殖医学采用2种冷冻技术：慢速冷冻法（有平衡的冻存法）和玻璃化冷冻法（无平衡的冷冻法）。这2种方法在全球范围内都被用于卵巢组织冻存，在临床常规实践中，建议应用慢速冷冻法进行卵巢组织冷冻。除了已公布的5例移植玻璃化冷冻卵巢组织后出生的婴儿外，所有其他新生儿都是通过慢速冷冻卵巢组织诞生的；玻璃化冷冻的未来意义尚不好估计。
2.5 卵巢组织移植 卵巢组织移植应在有强烈生育意愿的女性抗癌治疗结束至少3~6个月后进行，移植前应对不孕症的原因进行基本检查。即使仍有规律月经，如果患者卵巢储备已减退，也可以考虑进行移植。移植的年龄不应超过45岁，如果要在肿瘤治疗后尽早推荐移植，应根据疾病类型，并与肿瘤科多学科合作，同时考虑到患者的年龄和肿瘤预后。
卵巢组织的移植可通过腹腔镜手术进行，临床实践中，主要采用原位移植，包括移植到卵巢内/卵巢上，或者卵巢对应的盆壁腹膜后。与卵巢明显萎缩的情况相比，盆腔腹膜的血液循环较好，手术风险低，多采用盆腔腹膜下移植。冷刀切开血液丰富的盆腹膜，长度约0.5~1cm。通过钝性解剖形成腹膜袋，将复苏的组织块平行植入袋内。不建议1次移植将所有冻存的卵巢皮质片移植回体内，一般移植冻存卵巢组织的1/3~1/2，以便在卵巢功能丧失后再次移植。
在盆腔腹膜下原位移植的情况下，原则上自然妊娠是可能的。移植手术的风险与其他腹腔镜手术的风险相当，可能的风险是继发性出血或切口感染，发生率不到1%。北京妇产医院目前冻存400余例卵巢组织，移植10例，未出现术中术后并发症。
卵巢组织移植后一般需要2~6个月恢复卵巢功能，包括FSH水平下降，雌二醇水平上升，卵巢组织移植后95%的卵巢功能得到了恢复。如果输卵管通畅且无其他不孕因素，可尝试自然妊娠。为增加受孕的可能性，可以进行卵泡监排指导同房。在输卵管阻塞或其他不孕因素的情况下，需采用辅助生殖技术。卵巢组织移植后卵巢功能平均持续2~5年，最长可持续7年，但这取决于卵巢组织中的卵泡数量和卵巢冻存时的年龄。
3 青春期前女童卵巢组织冻存移植的应用
随着诊疗技术的进步，儿童癌症的5年生存率可达85%以上；然而，由于抗癌治疗，儿童癌症幸存者在成人后的生育力会明显下降，从而降低患者的生存质量。因此，对于要接受性腺毒性治疗的儿童来说，需重视生育力保护的咨询。对于青春期前的女童，卵巢组织冻存是惟一的生育力保护方法。青春期前进行卵巢组织冻存，待青春期后进行移植，采用此法，全球已有10多例活产。如果将青春期前的卵巢组织移植到持续原发性闭经的女孩，可成功诱导青春期。即使青春期前的卵巢没有表现出正常的卵泡活动，但其也会受到性腺毒性物质导致的DNA损伤，进而出现闭锁。儿童的卵巢皮质潜能确实比青少年或育龄期女性高的多，这通常会让人对性腺毒性治疗造成的损害程度有错误的估计。
2012年有研究报道，对患严重镰状细胞贫血的10岁女孩计划进行骨髓干细胞移植，在移植前要求行右侧整个卵巢组织冻存，骨髓干细胞移植后27个月，患者13岁时要求卵巢组织移植诱导青春期，2个月后双侧乳房、阴毛和腋毛开始发育；8个月后月经来潮，持续了4年，起初2年月经规律来潮，后来变得不规律。2013年丹麦哥本哈根团队报道了1例患尤文肉瘤的9岁女孩，放化疗前进行了单侧卵巢切除后冻存，4年半后移植了2片卵巢皮质以诱导青春期，移植4个月后，FSH降低至低水平，后续也恢复了正常月经周期，移植19个月后，移植物的卵巢功能停止。比利时团队2015年报道了对患镰状细胞贫血的14岁女孩进行骨髓移植，骨髓移植前进行了卵巢组织冻存，24岁时行卵巢组织移植，移植2年后自然妊娠，顺利分娩了一健康男婴。
2018年，法国团队报道了418名年龄小于15岁（平均6.9岁，最小0.3岁）的女童进行了卵巢组织冻存，313例为恶性，105例为良性，常见疾病诊断为神经母细胞瘤、急性白血病等，3例患者进行了卵巢组织移植（1例是为了青春期诱导，2例是为了恢复生育力），到报道时3例均无妊娠。2019年，美国团队报道了64例年轻患者进行卵巢组织冻存，年龄中位数12岁（5个月至23岁），53例为恶性疾病，6例为良性疾病需骨髓移植，5例为性发育障碍。48%的患者为月经初潮前，84%的患者进行了单侧卵巢切除术，无手术并发症。从手术到后续治疗时间平均为6d，没有由于卵巢组织冻存而推迟治疗。瑞典团队2021年报道了14岁女孩诊断为急性淋巴细胞白血病，冻存了右侧1/2卵巢组织，15年后进行卵巢组织移植，第1次移植未孕，第2次移植后体外受精（IVF）妊娠1次，之后自然妊娠1次。以上数据表明，青春期前进行卵巢组织冻存，待需青春期诱导或有生育需求时行冻存卵巢组织移植是可行的；但对于青春期前女童来说，冻存和移植间隔时间较长，所以青春期前女童进行卵巢组织冻存并且后续进行移植的病例数较少，仍需继续观察其安全性和有效性以及移植后卵巢内分泌功能持续时间。
4 卵巢组织冻存移植面临的挑战
4.1 卵巢组织移植早期的卵泡丢失 卵巢组织转运、处理及冷冻过程有良好的卵泡生存率，而移植过程会导致大量的卵泡丢失和卵巢储备的减弱，未来的研究应该集中在优化卵巢移植程序上。影响卵巢移植功能持续时间的一个关键因素是冻融和血运重建后存活的卵母细胞的数量，缺血是移植后卵泡丢失的主要原因，复氧大约需要4~5d，移植后早期，组织主要依赖无氧代谢，当新生血管提供氧合时，组织转变为有氧代谢。缺血不是惟一的损伤因素，新生血管形成后的氧合可能会触发活性氧自由基的形成，在移植的后期导致组织损伤。目前，国内外研究主要聚焦在促进血运重建以减少移植组织的损伤方面，主要采用血管内皮生长因子、血管生成素、激素、血管生成调节器、1-磷酸神经鞘氨醇、人脂肪来源的间充质干细胞等。
全卵巢移植可以通过血管吻合立即进行血运重建，显著降低缺血性损伤的风险；然而，冷冻保存完整的卵巢是一项具有挑战性的工作。考虑到人卵巢动脉和静脉的直径分别约为0.5mm和3mm，血管吻合是一个关键的技术。尽管仍存在障碍和技术困难，但仍鼓励人全卵巢组织冻存和移植，未来的研究可能会解决当前的大多数问题。
4.2 卵巢组织移植安全性 另一个关键问题是恶性细胞与卵巢组织移植一起重新植入的风险。欧洲五大中心285例卵巢组织移植表明，到目前为止，还没有出现与卵巢组织移植相关的复发病例，再次引入恶性细胞的风险很低，该技术是安全的，在目前的适应证下不会对健康造成威胁。但仍需注意血液病如白血病患者卵巢携癌风险高，即使从完全缓解的患者进行卵巢组织取材也不能排除这种风险。但已有白血病患者自体卵巢组织再移植后妊娠的病例报道，且未见复发。世界各地的研究小组一直在研究替代方法，移植人工卵巢也在研究中。（参考文献略）
