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01、临床靶点或驱动基因相关体细胞变异注释及解读

基于NGS技术检测肿瘤体细胞变异的实验流程可概括为以下几个主要环节：样本采集及质量控制、DNA提取、文库制备、测序、基因组数据生成及数据分析。

目前有多个循证分级系统可用于指导基因体细胞变异的临床解读。无论哪个分级系统都遵循一些共性原则，包括循证、跨癌种处理等，故其中并无优先推荐者。在阅读一份NGS报告时应先了解其变异解读依据的证据分级原则及其采用知识库的局限性，以帮助自己更好的理解报告内容。

02、NGS报告解读及临床决策

我们在拿到一份结构化循证报告后，需要基于特定逻辑建立临床解读知识库框架，并通过对开源知识库及海量科学文献的信息甄别、分级、编辑，不断完善机构内部临床解读知识库。在这里需要注意几点：

1—当面对一份体细胞变异“全阴报告”

即一份样本未能检出任何肿瘤体细胞突变时，应首先考虑以下两点：

首先，送检样本是肿瘤组织、外周血循环游离DNA或其他；结合样本质控信息及患者治疗史，综合判断样本中是否含有足够肿瘤成分，DNA总提取量和/或肿瘤占比是否可能低于NGS的LOD；

其次，选择的NGS panel（尤其是仅包含数个至数十个基因热点区域的小panel）是否与患者的肿瘤类型相匹配，即该肿瘤常见变异是否能被该panel覆盖。比如一份血检全阴报告，采用panel针对泛癌设计、覆盖上百基因的热点区域，对目标癌种常见变异的覆盖度>90%，此时的全阴，很可能仅提示肿瘤全身负荷较低或其他原因（如患者正接受有效的抗肿瘤治疗）导致释放入血的循环肿瘤DNA含量极低、未达检测平台的LOD。这种“全阴”不能反映肿瘤基因组变异状态，仅能提示“基因突变状态未知”。

2—针对NGS 报告中突变丰度及拷贝数的解读逻辑

在拿到一份NGS 阳性报告时，可能对其中检出的突变/重排的丰度及CNV 的拷贝数存在疑问。基于不同的样本类型，对AF 及CN 的理解可能存在一定差异。

第一个样本是基于组织样本的NGS检测，首先是对AF 绝对数值的解读。对于组织检测结果，可以根据X 基因突变（或重排）的AF 以及样本中的肿瘤占比，粗略判断该变异在肿瘤中的克隆占比。用于病理评估的样本仅为一张切片，不能完全代表检测样本整体；且病理评估还可能受局部肿瘤坏死等因素干扰，故病理评估结果仅供参考，可能与实际情况可能存在一定偏差。而当样本无法进行病理评估时（比如病理蜡卷标本），则只能以该样本中检出变异的最高突变丰度（maxAF）来反推可能的肿瘤占比。其次，其次对AF 相对数值的解读。组织样本中不同变异的相对丰度同样可以提供很多信息。

比如一份肺癌组织样本中，同时检出EGFR19del 和ALK 重排，二者相对丰度为5∶1；结合患者既往EGFR? 酪氨酸激酶抑制剂长期治疗史，我们有较大把握推断，该ALK 重排为获得性耐药机制，而非EGFR/ALK 双原发肿瘤。最后是对CNV的解读。面对NGS一份报告，首先需要注意CNV 有不同的报告形式，最常见的包括拷贝数（copy number，CN）及扩增倍数（ratio）。基于NGS检测得到的CNV 与荧光原位杂交检测得到的CN值或ratio值之间存在较大差异（详见表2）。

除基于组织样本的NGS检测外还有基于外周血cfDNA的NGS检测：NGS血检，检测对象是血浆中的cfDNA（circulating free DNA，cfDNA）。在实际临床应用及大多数科研发表中，仍以血浆样本中检出体细胞变异的maxAF作为ctDNA（circulating free DNA，cfDNA）含量的替代指标，可针对某一肿瘤患者进行不同临床节点的血检动态监控，以maxAF反映外周血ctDNA含量的动态变化，以此反映全身肿瘤负荷变化、预测治疗效果及生存预后。

3—针对单个变异对比多基因多变异的解读逻辑

根据不同NGS panel 的可报告范围，一份NGS阳性报告中的变异可能有多有少。对于多基因变异、特别是多个潜在驱动变异共存的情况，要结合肿瘤类型、既往治疗史、相对突变丰度、既往分子检测结果等信息综合判读，以推测不同变异之间的逻辑关系。

4—胚系突变分级注释

当无配对样本时，肿瘤样本的检测在变异注释及过滤过程中，需要建立生物信息学算法，以有效区分肿瘤体细胞突变和胚系突变，确认并过滤胚系多态性。如同时检测配对样本，则可明确区分体细胞突变和胚系突变。对检出的胚系突变，应参照ACMG推荐的胚系突变解读流程进行注释及解读。

5—NGS 可报告的基因组标签

首先，肿瘤突变负荷，在拿到一份NGS 报告，看到TMB 数值时，应综合考虑以下因素：选择的panel（有无准确测算TMB 的能力）、检出的肿瘤突变谱及其突变丰度（肿瘤占比是否足以评估TMB、突变谱特征与TMB高/低的组合是否合理）、TMB绝对值以及该数值在已检测的肿瘤样本中的相对排序等，综合评估TMB 水平及其可信度。

其次，微卫星不稳定性，对于MSI检测结果，应综合样本肿瘤占比（可参考肿瘤突变丰度）、TMB 水平［微卫星高度不稳定性（MSI?high，MSI?H）的肿瘤往往TMB?H］、肿瘤突变谱特征（MSI?H 可由MMR 基因失活性突变导致，且基因突变谱往往以Indel 为主）等信息综合分析，判断其可信度。

03、可报告范围及质量控制

最后应关注NGS报告中的样本主要质控参数、可报告范围（检测内容）、检测方法及其局限性等相关内容。一份报告的结果是否真实可信，或者是否能够回答临床医生最关心的问题，恰恰严重依赖于这些看似不起眼的“附加信息”，包括检测方法、可报告范围（检测内容）、质控参数、局限性说明等。无论报告模板如何，无论遵循哪个具体的变异临床解读逻辑，任何一份NGS报告的解读结果都不应抵触药物说明书或专业临床指南。医生在拿到一份NGS 报告后，不应拘泥于一条条检测报告结果本身，而应抽提出具体信息，整合到患者的实际临床背景中去讨论。