【据《Cancer Cell》2020年2月报道 作者：Zhiyuan Hu等】
张瑜 教授
医学博士、主任医师
博士研究生导师
湘雅医院妇产科教研室主任兼妇科主任
中国优生科学协会阴道镜和宫颈病理学分会常务委员
中国医师协会妇产科医师分会阴道镜及宫颈病变专业委员会委员
湖南省抗癌协会妇科肿瘤分会常委
湖南省医学会妇产科分会阴道镜与宫颈病理学组组长
湖南省女性生殖道感染性疾病专业委员会副主任委员
湖南省妇科肿瘤专业委员会委员
中国妇幼保健协会妇幼微创专业委员会委员
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肿瘤内异质性（intratumor heterogeneity）是肿瘤生存和进化的关键机制。遗传异质性已被认为是大多数癌症类型的生存机制。然而，即使具有相同遗传背景的癌细胞也可能具有不同的细胞表型，从而促进癌症的侵袭、转移和对化疗的耐药性等特性。
高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是致死率最高的妇科恶性肿瘤，这类肿瘤通常具有TP53突变和染色体的异常。并且，大部分卵巢癌病人在晚期才被发现，5年生存率只有30%左右。缺乏有效的方法来对HGSOC分类一直是卵巢癌治疗的一大难题。先前的研究已表明HGSOC的转录组异质性，但是大量转录体的分析会受到多种因素的干扰，例如拷贝数的变化和非癌细胞的污染。并且，这些分析没有考虑到一个肿瘤中多种细胞共存的可能性。这些混杂因素导致无法准确的将肿瘤分型来分析病人的预后。
最近大量研究证据表明SOC起源于输卵管上皮（FTE），研究报道了FTE由PAX8阳性分泌细胞、TUBB4阳性纤毛细胞和CD44阳性基底细胞组成。然而，是否还有其他的细胞亚型，这些亚型是否与HGSOC亚型有关，仍然是个谜。单细胞RNA测序（scRNA-seq）的出现使细胞亚型的识别成为可能。本研究就利用一种深度单细胞RNA测序技术Smart-Seq2对人类FTE的细胞亚型进行了鉴定，并探讨了与卵巢癌病人预后的关系。
研究者首先使用Smart-Seq2技术分析了5名卵巢癌患者和5名子宫内膜癌患者输卵管中的3877个单细胞（图1A）。在测序前采用流式细胞仪对单个FTE细胞（EpCAM+，CD45-）、白细胞（EpCAM，、CD45+）和基质细胞（EpCAM，、CD45-）进行鉴定和分类。为了排除临床样本中混杂的批处理效应和患者特有的变异性，他们使用了基于差异表达的聚类分析（图1B）。利用这种方法来区分上皮细胞和非上皮细胞（图1C）。为了了解细胞维持方法的影响，作者比较了新鲜和培养的FTE细胞的单细胞转录体。此外，三种条件下的假时间分析显示，与隔夜（overnight）培养组相比，长期培养（LT）细胞的转录本更类似于新鲜细胞（图1D和1E）。因此，为了避免保存方法带来的这些影响，研究者只对新鲜细胞进行下游分析。
图1 对人输卵管细胞的筛选
研究者接下来将新鲜的FTE细胞（2132）按先前建立的两个亚型分类：分泌细胞（1986）和纤毛细胞（146）（图2A）。然后，再根据它们的转录体识别出分泌细胞亚型（图2）。应用上述基于差异表达的聚类方法，在分泌细胞群中识别出9个具有不同转录谱的类别（cluster）。排除掉患者特异性（图2B）、没有差异和细胞应激可能的5个类别后，将分泌细胞分为了4种亚型（图2C-F）：1. 细胞周期亚型，主要是以下三种途径的基因表达上调，即细胞周期（如MCM2-7、MKI67、TK1和STMN1）、DNA修复（如FANCD2、FANCI和MSH2）和染色质重建；2. 分化亚型细胞，其RNA合成和运输途径相关的基因显著增加，并且与细胞周期亚型细胞有相同的几个标记物，这代表着细胞分裂后短暂的分化细胞群；3. KRT17亚型，其特征是主要组织相容性复合物（MHC）II类基因（例如，HLA-DQA1、HLA-DPA1和HLA-DPB1）、细胞角蛋白（KRT17和KRT23）、醛脱氢酶（ALDHs）等的表达上调，代表着一组具有重要生物学功能的细胞；4. 上皮-间质转化（EMT，epithelial-mesenchymal transition）亚型，其特征是高表达G蛋白信号调节因子和细胞外基质途径的基因。接着，作者为了排除癌细胞对非癌FTE细胞的潜在旁分泌作用，进一步验证了在良性标本FTE细胞中存在四种分泌亚型（图3）。另外，作者还发现了1种分泌-纤毛中间态细胞亚型以及1种特殊的组织原位T细胞（图4）。
图2 FTE细胞的单细胞RNA测序显示出四种分泌亚型
图3 在良性标本中验证FTE的分泌细胞亚型
图4 输卵管上皮非传统细胞亚型
基于对FTE单细胞转录体的分析，作者从上述五个主要FTE细胞亚型（细胞周期、EMT、分化、KRT17和纤毛）的转录组中提取出一个由52个标记基因相对表达量组成的参考矩阵（图5A）。随后，将所得参考矩阵利用支持向量回归模型对TCGA，AOCS等九个公共数据库中大量的HGSOC RNA-seq数据进行反卷积分析，以计算每个癌组织中五种细胞亚型的比例。根据数据集中细胞亚型的比例，这样的“分解”显示了肿瘤内的异质性（图5B-E）。值得注意的是，研究者们在多个数据集中发现了一类高EMT（EMT-high）的肿瘤。这些肿瘤高表达与之前被定义为“间充质”HGSOC亚型相关的基因。他们发现这些肿瘤的标记基因在细胞外基质、局灶性粘附和PI3K-AKT信号传导途径中富集。此外，三个关键的EMT转录因子TWIST1、TWIST2和SNAI2在EMT-high型肿瘤中上调（图5G），而抑制EMT的miRNA-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429）在EMT-high型肿瘤中（图5H）表达下调，提示EMT可能是该肿瘤亚型间充质癌细胞富集的潜在机制。接下来，他们进一步发现EMT细胞亚型的比例和病人预后明显呈负相关（图6A），且这一相关性在九个独立数据库中都可被重复出来。
图5 反卷积分析揭示浆液性卵巢癌表型异质性
图6 Kaplan-Meier曲线显示EMT评分对生存率的影响。
为了进一步证明EMT及其他四种细胞状态的信号可来自于癌细胞，研究者们利用激光捕获显微切割技术（LCM）获取了纯度更高的肿瘤样本，并进行了转录组测序，对LCM样本数据分析重现了在TCGA等公共数据库里的发现，并通过免疫荧光染色在组织切片和卵巢癌细胞系KURAMOCHI中进行了验证。
图7 高EMT肿瘤包括间充质样的癌细胞
总之，这项研究通过对6000多个单细胞的深度测序，确定了输卵管上皮细胞亚型，显示了浆液性卵巢癌起源——人类输卵管上皮组织新的细胞“蓝图”，再将FTE亚型投射到肿瘤上以帮助SOC的精确分子分型，并且定义了一个不良预后的EMT-high亚型。这项研究对卵巢癌的预后分析带来重要影响，并且对EMT-high肿瘤亚型的临床治疗方法开发带来启发。通过反卷积的分析方法，发现癌症的细胞状态可以由来自正常来源细胞的细胞状态来反应，具有极高的应用价值。
文章整体思路（本图来自于作者推特）
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