本期OC文献精读，小编特邀苏州大学附属第一医院妇产科医生周金华为大家分享2018年11月14日发表在British Journalof Cancer上的一篇文章，题目为“Long-term treatment with the PARP inhibitor niraparib does not increase the mutation load in cell line models and tumour xenografts”。中文为“长期使用PARP抑制剂尼拉帕利治疗不会增加细胞系和肿瘤移植瘤模型的突变负荷”。这篇文章通过研究证明了尼拉帕利在肿瘤治疗过程中没有致突变性。
周金华 教授
苏州大学附属第一医院
MD. Anderson癌症中心博士后
江苏省青年医学重点人才
“姑苏卫生”青年拔尖人才
国家自然科学基金通讯评审专家
中国妇幼保健协会妇幼微创专业委员会青年委员
中国妇幼保健协会 妇科肿瘤防治专业委员会委员
江苏省医师协会微无创医学专业委员会青年委员
中国研究型医院学会妇科肿瘤专业委员会青年委员
00:000:00 音频 1.研究背景
目前使用聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂对具有同源重组缺陷的肿瘤细胞进行靶向治疗。鉴于PARP抑制剂需在维持治疗过程中长期使用，该类药物在治疗过程中任何潜在的诱变效应都可能加速耐药的发展或损害良性体细胞。
2.研究方法
通过在细胞系中连续暴露尼拉帕利30天来模拟临床前和临床中人体内的尼拉帕利治疗，为了避免治疗分析过程中可能出现的潜在耐药细胞的产生，研究过程中只从每个细胞系中分离出一个单克隆细胞进行分析（图1a）。
图1a:长期治疗示意图
3.研究结果
细胞系中单核苷酸变异（SNVs）
在BRCA1野生型DT40细胞系安慰剂组中发现102±29个(SD)单核苷酸变异，而尼拉帕利治疗组发现125±11个SNVs，二者比较无显著差异(图2 a, p = 0.15, t检验)。在BRCA1纯合突变DT40细胞系中，安慰剂组自发突变(849 ± 93)是之前数据的8倍，与尼拉帕利治疗组结果相似(图2 a，b)。DLD-1细胞表现出高水平的自发性SNVs突变，在60天的培养周期内获得9799±1910个基因组突变，与尼拉帕利治疗组数据无差异(图2a, p = 0.29)。此外，BRCA1突变的SUM149PT乳腺癌细胞系的突变率较低，仅有608±146个单核苷酸变异，该结果又一次与尼拉帕利治疗组数据相似(图2a, p = 0.56)。
图2a: 使用安慰剂或尼拉帕利治疗后，每个细胞系中每个测序基因组产生的SNVs的平均数量。红色符号表示单个样本的值。
三联体单核苷酸变异图谱显示了突变碱基和突变碱基之前与之后的碱基，通过对比也没有显示出尼拉帕利对BRCA1野生型和纯合突变型DT40细胞的任何诱变作用。 (图2b-e)。
图2a: 使用安慰剂或尼拉帕利治疗后，每个细胞系中每个测序基因组产生的SNVs的平均数量。每个突变类型在图表上部显示。根据前面和后面核苷酸的标识被分成的16个类别在图表下部显示。标识按字母顺序排列，由于空间限制而没有显示出来。
使用t-分布领域嵌入算法 (t-SNE)能清楚地从不同细胞系中分离单个三联体图谱，相似的单个三联体图谱表明尼拉帕利缺乏诱变效果(图2f)。
图2f: t-分布领域嵌入算法 (t-SNE)，对单个样品的三联体SNV图谱进行相似性和差异性的可视化研究。
在细胞系中基因的插入缺失和大片段重组
研究将所有50 bp以下的短插入/缺失进行了分类，研究发现安慰剂组与尼拉帕利治疗的细胞株中插入或删除的数量没有显著差异 (图3a,b)。研究者根据序列的位置对基因缺失进行分类，在DLD-1细胞系中存在的大量重复序列的短缺失证实了其微卫星不稳定性表型(图3c)。
图3：在长期治疗期间产生的插入和缺失。a短插入或删除的平均数，b在安慰剂处理或使用指定浓度的尼拉帕利处理后，每个指定细胞系中产生的每个测序基因组，c按序列前后对检测到的短删除事件进行分类。分类的最小长度为1 bp。在所有图片中误差条表示SEM。差异有统计学意义(p < 0.05，无配对t检验)。
尼拉帕利治疗乳腺癌移植瘤模型
为了在体内验证细胞系扩增的结果，该实验将植入乳腺癌细胞系的小鼠用尼拉帕利治疗28天，然后提取肿瘤细胞组织进行二代测序。尼拉帕利治疗虽然对小鼠模型的肿瘤生长有轻微的抑制作用，但没有使肿瘤体积减小(图4a , b)。通过对安慰剂组和尼拉帕利治疗组的样品进行比较，发现肿瘤细胞突变数量没有增加，突变谱也没有发生变化，这说明尼拉帕治疗组在裸鼠体内没有产生可检测的亚克隆突变(图4c, f, g)。
图5：尼拉帕利对PDX模型中亚克隆肿瘤特异性突变形成的影响。a，b肿瘤细胞在PDX模型中生长，显示的是4个独立样品的平均值和SEM。c从安慰剂组或尼拉帕利治疗组的动物中提取肿瘤样本进行外显子组测序，数据分析SNVs(上)、短插入(中)和短缺失(下)。红色符号表示单个样本的值；误差条SEM。差异有统计学意义(p < 0.05，非配对t检验)；NS：无统计学意义。g，h安慰剂治疗(上)或尼拉帕利治疗(下)的PDX肿瘤样本平均三联体SNV图谱。< 0.05，无配对t检验)。
4.研究结论
结果表明长期使用PARP抑制剂抑制DNA修复没有或只产生有限的诱变作用。因此，在癌症治疗中长期使用PARP抑制剂而导致的突变预计不会促进耐药性的遗传进化，也不会产生显著的免疫原性抗原决定簇(neoepitope)或诱发继发性恶性肿瘤。
专家点评
由于细胞系具有很强的增殖分裂能力，在为期30天的实验周期内细胞进行多次传代，可以模拟出长期服用PARP抑制剂患者体内的细胞更新换代频率。该实验数据显示PARP抑制剂长期治疗不会引起治疗耐药的突变，且肿瘤的自发致突变过程和其他治疗药物的基因诱变将与PARP抑制剂耐药的进化速度最为相关。尼拉帕利作为一种长期服用的药物，不但没有致突变作用，而且对体细胞和肿瘤细胞的诱变作用不大。
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